Ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất rễ tơ Ké hoa đào có hàm lượng imperatorin cao

Đây là giải pháp giải quyết vấn đề thoái hóa nuôi nhân sinh khối rễ ở quy mô sản xuất công nghiệp, cung ứng nguồn rễ tơ Ké hoa đào phục vụ sản xuất dược liệu.

Trong khoảng hơn 20 năm trở lại đây, nhiều công bố nghiên cứu của thế giới đã chứng minh ưu điểm nổi bật về các hoạt tính sinh học của cây Ké hoa đào, đặc biệt là rễ của loài thực vật này. Rễ tơ Ké hoa đào có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase; chống oxi hóa và kháng khuẩn rất cao, có thể hướng đến việc sử dụng làm thảo dược đặc trị bệnh tiểu đường tuýp 2 mà ít tác dụng phụ. Nuôi cấy rễ thực vật nói chung, hay rễ tơ Ké hoa đào nói riêng, luôn hướng tới mục đích sau cùng là thu nhận được những hợp chất tự nhiên có giá trị. Tuy nhiên, để thu nhận các hợp chất tự nhiên ở hiệu suất cao thì trước tiên luôn cần tối ưu các quy trình nuôi cấy nhằm chủ động sản xuất, cung ứng các nguồn dược liệu quý mà không phụ thuộc vào các loài thực vật ngoài tự nhiên, lại đảm bảo thu được nguồn sinh khối lớn.

Ở rễ tơ, sự ổn định di truyền nhiễm sắc thể luôn được coi là thế mạnh so với nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào hay rễ bất định. Tuy nhiên, sự bất ổn định của rễ tơ nuôi cấy vẫn còn cao (khoảng 10%). Thêm vào đó, việc nuôi cấy liên tục rễ tơ rất mất thời gian, tốn kém và có thể gây ra sự mất ổn định kiểu hình và kiểu genne của rễ tơ. Đặc biệt, việc tạo ra và chọn lọc một dòng rễ tơ tiềm năng trong hàng trăm dòng dễ tơ khác từ cùng một loài thực vật là vô cùng tốn kém và hao tốn thời gian. Thêm vào đó, tỷ lệ thay đổi di truyền tính trạng biểu sinh (epigenneetic) có thể gia tăng trong quá trình nuôi cấy nhiều lần liên tục gây ra sự mất dần khả năng tái sinh cũng như tổng hợp chất thứ cấp.

Được biết, hai công ty sử dụng rễ tơ làm dược liệu có quy mô sản xuất lớn trên thế giới là CBN BIOTECH (Hàn Quốc) và ROOTec (Thụy Sỹ) cũng từng báo cáo là gặp phải một số vấn đề tương tự như sự thoái hóa di truyền nguồn mẫu làm giảm hiệu suất thu nhận hoạt chất trong quá trình khai thác, nên phát triển một quy trình bảo quản lâu dài nhằm lưu trữ sự toàn vẹn các đặc tính dòng rễ tơ cao năng là điều vô cùng cần thiết. Mặt khác, khi rễ tơ được bảo quản tại điều kiện nhiệt độ thấp, các rủi ro gặp phải như là sự hình thành các tinh thể nước đá trong mô, mẫu bị tổn thương do tiếp xúc với các chất độc trong bảo quản đã gây ra nhiều bất lợi trong quá trình lưu trữ. Do đó, cần có bước nghiên cứu đặc tính loài thực vật mục tiêu và thử nghiệm các quy trình bảo quản nhằm giảm thiểu tối đa các rủi ro, nguồn rễ tơ sau tái sinh sẽ vẫn duy trì được tính ổn định di truyền cũng như hàm lượng các hợp chất thứ cấp có giá trị.

Chính vì vậy, nhóm nhà khoa học đang công tác tại Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQG TP.HCM) đã triển khai nhiệm vụ khoa học và công nghệ “Nghiên cứu chọn lọc, sản xuất và bảo quản lạnh sâu các dòng rễ tơ Ké hoa đào (Urena lobata L.) có hàm lượng imperatorin cao”.

PGS.TS Quách Ngô Diễm Phương báo cáo kết quả triển khai nhiệm vụ khoa học - công nghệ

PGS.TS Quách Ngô Diễm Phương, chủ nhiệm nhiệm vụ cho biết mục đích của nghiên cứu là xây dựng quy trình chọn lọc dòng rễ tơ có hàm lượng imperatorin cao, xây dựng quy trình sản xuất dòng rễ tơ đã chọn lọc ở quy mô pilot với sự ổn định về chất lượng dòng rễ, từ đó xây dựng quy trình bảo quản trong thời gian dài dòng rễ tơ cao năng đã chọn lọc nhằm giảm chi phí và nhân công cấy chuyền. Đây cũng chính là giải pháp cho vấn đề thoái hóa nuôi nhân sinh khối rễ ở quy mô sản xuất công nghiệp.

Báo cáo trước hội đồng tư vấn nghiệm thu nhiệm vụ do Sở KH&CN TP.HCM tổ chức trong năm 2023, PGS.TS Quách Ngô Diễm Phương khẳng định việc nghiên cứu nuôi cấy rễ tơ loài cây Ké hoa đào ở Việt Nam hầu như chưa được quan tâm, trong khi việc thu nhận hoạt chất imperatorin (hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học như ức chế hoạt động phân chia mạnh mẽ của tế bào ung thư, kháng viêm, điều trị cao huyết áp, kháng khuẩn và virus) hiện nay trên thế giới lại được thu nhận ở quy mô sản xuất từ rễ Ké hoa đào. Ở pha nghiên cứu đầu tiên được triển khai hồi năm 2017, các nhà khoa học đã thành công trong việc tạo được nguồn nguyên liệu rễ tơ Ké hoa đào khi ứng dụng công nghệ sinh học thực vật (nuôi cấy rễ tơ, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy, can thiệp con đường biến dưỡng hoạt chất trong nuôi cấy thực vật...).

"Do đó, việc nghiên cứu, lựa chọn nuôi cấy ở quy mô sản xuất công nghiệp nguồn rễ tơ loài này để có thể tạo được nguồn nguyên liệu đủ tiêu chuẩn sản xuất imperatorin trong tương lai (ổn định hàm lượng hoạt chất, không bị thoái hóa, không bị nhiễm dư lượng hóa chất), ở mức chi phí duy trì hợp lý là điều cấp thiết và hiển nhiên", PGS.TS Quách Ngô Diễm Phương thông tin thêm.

Nhóm triển khai nhiệm vụ đã chọn lọc dòng rễ tơ Ké hoa đào bằng các chỉ tiêu trực tiếp là tốc độ tăng trưởng và hàm lượng hoạt chất imperatorin đồng thời cũng thực hiện chọn lọc bằng chỉ tiêu gián tiếp là hình thái rễ và đặc tính di truyền phân tử của rễ. Qua đó, xây dựng quy trình chọn lọc dòng rễ tơ cây Ké hoa đào cao năng bằng hình thái và chỉ thị phân tử ở giai đoạn sớm của quá trình nuôi cấy giúp giảm chi phí đầu tư cho nhà sản xuất.

Cụ thể, quy trình cảm ứng tạo rễ tơ trên mẫu lá cây Ké hoa đào được tối ưu các điều kiện cảm ứng theo kết quả nghiên cứu từ pha 1 năm 2017 (độ tuổi cây: 15 ngày tuổi, loại mô xâm nhiễm: lá, thời gian tiếp xúc với vi khuẩn: 20 phút), đạt được hiệu suất tạo rễ cao hơn 90%. Trong khoảng thời gian từ 3-7 ngày sau khi đồng nuôi cấy, rễ bắt đầu xuất hiện tại nhiều vị trí có tạo vết thương như cuốn hoặc vùng thân lá. Sau 14 ngày, chiều dài rễ tạo thành đạt được 2,67cm. Quan sát các đặc điểm hình thái cho thấy, rễ có xu hướng phát triển không hướng xuống môi trường nuôi cấy; rễ mọc thẳng, một số sợi phân nhánh hoặc có nhiều lông mịn tại vùng chóp rễ. Rễ tơ được tạo thành từ quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn bởi sự sát nhập ngẫu nhiên trình tự genne của vi khuẩn vào thực vật, mỗi vị trí sát nhập có thể tạo ra một kiểu hình rễ tơ khác nhau. Quá trình cảm ứng tạo rễ tơ xuất hiện sự phân hóa hình thái rễ trong 30 ngày nuôi cấy đầu tiên tạo nên 6 kiểu hình thái đặc trưng khác biệt (nhóm dòng A, B, C, D, E và G) từ 138 dòng rễ tơ khác nhau.

Sự khác biệt về hình thái giữa các dòng rễ tơ sau mỗi 10 ngày. (A, B: rễ tơ sau 10 ngày cảm ứng. C, D, E: rễ tơ sau 20 ngày cảm ứng. F: dòng 1, G: dòng 2, H: dòng 3, I: dòng 4, J: dòng 5, K: dòng 6: rễ tơ sau 30 ngày cảm ứng).

Các kiểu hình thái khác nhau sau đó lại được ghi nhận có sự khác nhau về tốc độ tăng trưởng và hoạt tính ức chế glucosidase. Rõ ràng, khi nuôi cấy rễ bằng công nghệ này, chúng ta cần phải có quy trình chọn lọc dòng mới có thể đảm bảo được sự ổn định về khả năng tăng trưởng và hàm lượng hoạt chất tích lũy. Trong việc chọn lọc các dòng rễ tơ cao năng, tốc độ tăng trưởng được xem như là chỉ tiêu trực tiếp được ưu tiên sử dụng. Tuy nhiên, khi so sánh với các chỉ tiêu hình thái ban đầu ghi nhận được, nhóm thực hiện nhận thấy đã có sự thể hiện tương quan giữa hình thái và tốc độ tăng trưởng ngay giai đoạn sàng lọc ban đầu này: nhóm dòng có độ dày trục rễ chính và mức độ phân nhánh rễ cao (nhóm dòng C và E) có giá trị tăng trưởng cao hơn những nhóm dòng có rễ mỏng và ít phân nhánh (nhóm dòng A, B, D và G), trong đó các dòng rễ thuộc nhóm B có màu sắc rễ trong, khác biệt rõ rệt với màu đục của các dòng rễ còn lại, đều cho tốc độ tăng trưởng kém nhất. Đây là dấu hiệu khả quan giúp nhóm nghiên cứu có thể tự tin với giả thuyết hoàn toàn có thể sử dụng chỉ tiêu hình thái để sàng lọc dòng rễ cao năng ngay thời điểm rễ tơ mới phát sinh ban đầu, sau đó kết hợp chọn lọc dòng rễ tơ cao năng dựa trên hình thái và chỉ thị phân tử. Tiếp đó, nhóm thực hiện nuôi cấy nhân sinh khối dòng rễ tơ đã chọn lọc bằng hệ thống bioreactor 3-10 lít với sự ổn định về hàm lượng imperatorin. Từ đó, xây dựng quy trình sản xuất dòng rễ tơ đã chọn lọc ở quy mô pilot với sự ổn định về chất lượng dòng rễ bằng chỉ thị imperatorin.

Quy trình sản xuất dòng rễ tơ Ké hoa đào ở quy mô pilot

Bảo quản lạnh sâu (cryopreservation) trong thời gian dài là phương pháp lưu trữ các tế bào hay mô/cơ quan ở nhiệt độ cực kỳ thấp, thường là nhiệt độ hóa lỏng của nitơ (-196 độ C). Tại nhiệt độ này, toàn bộ các quá trình biến dưỡng bị dừng lại và do đó cho phép tế bào duy trì các đặc tính hiện có. Đây có thể xem là phương pháp bảo quản dài hạn mang tính khả thi duy nhất khi có thể đảm bảo sự hiệu quả về an toàn và tiết kiệm chi phí.

Kết quả đánh giá hiệu quả của 4 quy trình bảo quản phổ biến cho thấy chỉ có quy trình bảo quản sử dụng kỹ thuật nhỏ giọt - thủy tinh hóa cho hiệu quả tái sinh của rễ tơ sau bảo quản là cao nhất (36,67%). Dù rằng đã xác định được các chất bảo quản ít gây độc hoặc không gây độc cho tế bào nhưng tỷ lệ hồi phục của rễ sau bảo quản lạnh còn kém. Đó có thể là do không được bảo vệ tốt bởi các chất bảo quản hoặc một số yếu tố khác như độ tuổi rễ tơ chưa thích hợp (quá già hoặc quá non), sợi rễ quá mỏng dẫn đến bị ảnh hưởng mạnh khi tiếp xúc với dung dịch bảo quản hoặc quá dày tạo hiệu quả mất nước không cao.

Do vậy, nhóm thực hiện đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng thích hợp (thời gian và nhiệt độ tiếp xúc với dung dịch bảo quản, thời gian tiền nuôi cấy, ảnh hưởng của độ tuổi rễ, ảnh hưởng của chiều dài rễ, kiểu cấu trúc rễ). Sau khi cải thiện quy trình, rễ tơ sau bảo quản có thể đạt được tỷ lệ tái sinh lên 93,33%, gấp 2,5 lần so với quy trình ban đầu (36,67%). Thêm vào đó, rễ tái sinh có chiều dài đạt 4,65cm, gấp 1,5 lần so với quy trình ban đầu (3,04cm). Từ đó, nhóm thực hiện xây dựng quy trình bảo quản dòng rễ tơ cao năng đã chọn lọc từ cây Ké hoa đào trong thời gian 4-6 tháng.

Nhóm thực hiện cũng chứng minh hiệu quả của kết quả nhiệm vụ thông qua việc nuôi cấy dòng rễ tơ Ké hoa đào có hàm lượng hoạt chất imperatorin cao ở quy mô bioreactor (3-10L) có áp dụng 2 quy trình chọn lọc dòng và bảo quản lạnh sâu so với sinh khối rễ không áp dụng trong cùng thời gian.

Kết quả cho thấy, quy trình đầu tiên (A1) là rễ tơ vừa mới cảm ứng không qua chọn lọc có tăng trưởng cũng như hàm lượng imperatorin nhỏ nhất. Giá trị DGI (chỉ số tăng trưởng theo sinh khối khô) có tăng nhẹ ở thế hệ thứ 3 tuy nhiên vẫn đạt thấp nhất so với các nghiệm thức còn lại. Thêm vào đó, imperatorin chỉ hiện diện sau lần cấy chuyền thứ 2 nhưng với hàm lượng thấp hơn từ 2-3 lần so các dòng rễ khác. Có thể thấy, việc có áp dụng chọn lọc dòng cao năng đã làm cho cả 3 dòng rễ ở các nghiệm thức A2, A3 và A4 đều có sự hiện diện imperatorin ngay từ thế hệ đầu tiên. Tuy nhiên, đối với dòng rễ A3 (không có áp dụng quy trình bảo quản) thì sau khoảng 4-6 tháng cấy chuyền liên tục, dòng rễ này có hiện giảm tăng trưởng đáng kể mặc dù vẫn duy trì được hàm lượng imperatorin so với đối chứng mới được chọn lọc là A2. Tuy nhiên chính điều này sẽ làm cho năng suất thu nhận imperatorin sau cùng giảm nên sẽ không thật sự hiệu quả. So với đối chứng là A2 có các dòng rễ mới được chọn lọc, chỉ có các dòng rễ cao năng là A4 có bao gồm được bảo quản với quy trình thích hợp, dòng rễ A4 mặc dù chậm tăng trưởng hơn ở thế hệ đầu tiên nhưng chỉ sau thế hệ thứ 3 đã cân bằng so với A2. Thêm vào đó, mặc dù đã được bảo quản 6 tháng trong nitơ lỏng, dòng A4 vẫn duy trì được nồng độ imperatorin tương ứng với A2.

Bên cạnh những kết quả nghiên cứu đạt được và cũng đã được Hội đồng tư vấn nghiệm thu nhiệm vụ do Sở KH&CN TP.HCM thông quan, PGS.TS Quách Ngô Diễm Phương cho biết thêm rằng nhóm nghiên cứu nhận thấy vẫn có thể tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về lĩnh vực này để cải tiến hơn nữa quy trình sản xuất cũng như chất lượng sản phẩm đầu ra, cũng như giảm thiểu chi phí đầu tư; và đồng thời nhóm các nhà khoa học tại Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQG TP.HCM) chủ động kiến nghị Sở KH&CN TP.HCM trong thời gian tới hỗ trợ công tác chuyển giao quy trình sản xuất rễ Ké hoa đào trong thu nhận imperatorin để sớm ứng dụng vào sản xuất, vì thị trường trong nước lẫn quốc tế hiện có nhu cầu rất lớn về imperatorin.