Chủ động ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất dược liệu

Cây bá bệnh (Eurycoma logifolia Jack) còn được biết với tên gọi khác trong dân gian như cây bách bệnh, mật nhân hay tongkat ali của Malaysia, phổ biến rộng rãi hơn trong khu vực và trên thế giới, được xác định là một loại dược liệu quý dùng trong cải thiện chức năng sinh lý, sinh sản ở nam giới, chữa trị sốt rét, tiểu đường, kháng viêm, giảm stress, tăng cường miễn dịch, phòng loãng xương và ngăn ngừa khối u.

Hiện nay, cá thể cây bá bệnh sinh trưởng tự nhiên là có hạn, mọc chủ yếu ở khu vực miền Trung, Tây Nguyên, và tỉnh Tây Ninh, nhưng phải đối mặt tình trạng khai thác ồ ạt, chủ yếu bằng hình thức đào lấy rễ, dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng và khan hiếm nguồn dược liệu.

Nhằm góp phần giải quyết sự cấp thiết về nguồn cung cho loại dược liệu quý này, với sự hỗ trợ từ phía Sở KH&CN TP.HCM, từ tháng giữa năm 2019, Viện Sinh học Nhiệt đới đã bắt đầu triển khai nhiệm vụ khoa học và công nghệ “Nghiên cứu nhân sinh khối rễ tơ cây bá bệnh (Eurycoma Longifolia) bằng lò phản ứng sinh học (bioreactor) hướng đến sản xuất quy mô lớn”.

Mục tiêu của đề tài nhằm nghiên cứu quy trình tạo được rễ tơ cây bá bệnh trong phòng thí nghiệm, từ đó xây dựng công nghệ nhân sinh khối rễ trong hệ thống nuôi cấy bioreactor 20 lít, giúp hỗ trợ chuyển giao công nghệ để đi đến sản xuất quy mô lớn, phục vụ cho nghiên cứu và tiêu dùng. Từ rễ tơ thu được, một nhiệm vụ khác cũng được đặt ra cho nhóm nghiên cứu là thực hiện chiết xuất cao thành phẩm.

Đến tháng 5/2021, nhóm nghiên cứu đã thành công trong việc khảo sát các điều kiện chuyển gen thích hợp từ cây in vitro và tạo, chọn được 2 dòng rễ tơ tăng trưởng tốt, tích lũy hàm lượng hoạt chất eurycomanone tương đương với rễ tự nhiên. Từ đó cũng đã nghiên cứu xác lập được quy trình nuôi nhân rễ tơ thu sinh khối trong bioreactor 20 lít, thực hiện chiết cao từ rễ tơ thành phẩm, ghi nhận những kết quả tích cực cho lĩnh vực sản xuất dược liệu.

Nhân giống trong môi trường phòng thí nghiệm

Báo cáo tại buổi nghiệm thu đề tài, TS. Phan Tường Lộc cho biết, vật liệu rễ tơ bá bệnh có tốc độ sinh trưởng nhanh, liên tục sản sinh ra hoạt chất ở mức cao, đồng thời thích hợp nuôi cấy tùy chọn.

Rễ tơ nuôi trong hệ thống nuôi Bioreactor 20 lít.

Thực hiện đề tài, nhóm nghiên cứu sử dụng hạt từ cây bá bệnh 6 năm tuổi có nguồn gốc từ Vườn quốc gia Bái Tử Long được trồng trong nhà màng tại Viện Sinh học nhiệt đới, chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogens 43057 (ATCC), Eurycomanone tinh khiết 95% dùng cho HPLC (ASB-00005393-005) và các môi trường nuôi thực vật (MS, 1/2 MS, SH, WP).

Cụ thể, hạt cây bá bệnh được làm sạch, khử trùng bằng dung dịch cồn 70%, sau đó vô trùng bằng dung dịch Javel (6% NaClO) trong vòng 20 phút, đảm bảo cho 100% hạt sạch nhiễm nấm, khuẩn và 80,3% nảy mầm. Phần phôi hạt sau đó được bóc tách và cấy trên môi trường MS được bổ sung 0,5 mg/l GA3 để tạo cây in vitro, sau 35-42 ngày sẽ thu các lá chét làm vật liệu thì nghiệm.

Đối với A. rhizogenes, dịch vi khuẩn này được nuôi trong 50 ml môi trường NB lỏng trong thời gian 42-48 giờ. Sau đó ly tâm thu sinh khối, rồi hòa lại trong môi trường ½ MS, bổ sung thêm acetosyringone và tiếp tục nuôi ở điều kiện như trên khoảng 30 phút trước khi thực hiện gây nhiễm mô lá.

Trong khi đó, các lá chét được cắt thẳng góc với gân chính bỏ phần đầu lá và cuống lá khoảng 1mm, ngâm trong dung dịch vi khuẩn đã chuẩn bị trong 20 phút, sau đó được thấm khô dịch và cấy lên môi trường 1/2 MS bổ sung acetosyringone cùng nồng độ với dịch vi khuẩn để đồng nuôi cấy.

Quy trình chuyển gen tạo rễ tơ

Theo TS. Phan Tường Lộc, quy trình xử lý cảm ứng tạo rễ tơ với vi khuẩn A. rhizogens trên mẫu lá được tối ưu ở giai đoạn gây nhiễm với nồng độ acetosyringone là 0,1 mM, mật độ vi khuẩn ở OD₆₀₀ là 0,8, trong thời gian đồng nuôi cấy tốt nhất là 3 ngày trên môi trường ½ MS lỏng với 3% đường sucrose. Sau dó, mẫu được loại bỏ vi khuẩn và nuôi tiếp trên môi trường rắn cùng loại và rễ hình thành trong thời gian từ 10 đến 20 ngày. Sau 35 ngày, các dòng rễ được chọn, tách dòng và tiếp tục đánh giá sự sinh trường trong 30 ngày  tiếp theo và định lượng mức tăng sinh khối trên môi trường SH lỏng với 3% sucrose cũng như kiểm tra sự tích lũy eurycomanone của sinh khối. Hai dòng rễ tơ R1, R2 được chọn có khả năng tăng trưởng tốt nhất, dựa trên chỉ tiêu sinh khối (có độ dài tốt và phân nhánh liên tục) và tích lũy hoạt chất eurycomanone tương đương với cây tự nhiên, khi phân tích bằng sắc ký lỏng áp suất cao (HPLC).

Sự hình thành rễ tơ trên mẫu lá bá bệnh sau 12 ngày (a) và 28 ngày (b).

Tuy nhiên dòng rễ tơ R2 cho thấy có hiệu quả sản xuất eurycomanone cao nhất, thích hợp để nghiên cứu quy trình phục vụ sản xuất quy mô lớn. Do đó, nhóm nghiên cứu chọn dòng rễ tơ R2 để thực hiện các bước tiếp theo.

Quy trình nuôi rễ tơ trong bioreactor 20 lít

Dòng rễ tơ đủ tiêu chuẩn sẽ được nhân sinh khối làm nguồn mẫu cấy trong điều kiện bình tam giác dung tích 250ml. Cụ thể, mỗi bình tam giác 250ml bao gồm 0,3 gam mẫu, 75ml môi trường SH và được chiếu sáng 12 giờ ở mức 1500 lux trong vòng 21 ngày. Sau thời gian trên, sinh khối rễ sẽ được loại bỏ rễ già hóa nâu, và lựa chọn chính xác 40 gam  để cấy vào hệ thống bioreactor 20 lít được chuẩn bị sẵn.

Môi trường trong bioreactor gồm 10 lít môi trường SH 4% sucrose, chiếu sáng ở cường độ 1500 lux. Quá trình nuôi rễ cây cũng được sục khí 0,2 vvm/2 tuần đầu và 0,4 vvm/2 tuần cuối, kết hợp cảm ứng với MeJA 0,1 mM vào hai ngày cuối của kỳ nuôi 28 ngày. Sau 28 ngày, rễ tơ đã có thể thu hoạch.

TS Phan Tường Lộc cho biết, việc nuôi bioreactor cần được thực hiện và kiểm soát nghiêm ngặt từ đầu để tránh sự nhiễm tạp. Khi bị nhiễm tạp, môi trường sẽ bị đục hoặc xuất hiện các dạng vón cục của nấm thì phải dừng nuôi.

Khi thu hoạch, sinh khối được rửa, loại bỏ hoàn toàn môi trường nuôi bằng nước sạch, rồi mang sấy khô ở nhiệt độ 50-60^oC đến khi khối lượng không đổi. Sau đó, rễ được giã nhuyễn, ly trích bằng ngâm dầm trong methanol kết hợp siêu âm ở 50^oC (50 ml/lần), ly tâm (5 phút, 5000 vòng/phút) và thu phần dịch ly trích.

Kết quả phân thích mẫu cho thấy, rễ tơ thu hoạch trong bình bioreactor có mức tăng trưởng đạt 42,8 lần.

Bên cạnh đó, chiết cao methanol từ rễ tơ nuôi trong bioreactor 20 lít đạt hiệu suất 30,2%, hàm lượng eurycomanone là 3,37 mg/g. Cao sau khi trích ly có thể chất đặc, cứng, bề mặt mịn, hơi dính, màu nâu đen sẫm, mùi hương đặc trưng của bá bệnh, vị đắng và tan hoàn toàn trong nước.

Bên cạnh đó, các kiểm chứng sinh học độc lập về giới hạn nhiễm kim loại nặng độc, vi sinh vật của cao chiết xuất từ rễ cây bá bệnh cũng ghi nhận đạt tiêu chuẩn trong lĩnh vực thực phẩm, dược liệu và các ngành sản xuất liên quan.

Với thành công từ quy trình nuôi rễ tơ trong hệ thống bioreactor 20 lít, Viện Sinh học nhiệt đới cho biết có thể kết hợp nhiều đơn vị bình 20 lít để bước đầu sản xuất sinh khối cũng như sẽ tiếp tục nghiên cứu cải tiến các giai đoạn sục khí và mở rộng quy mô trên hệ thống nuôi bioreactor 30 lít, đồng thời tiếp tục sử dụng quy trình chuyển gen để tạo ra những dòng rễ có năng lực tốt hơn đối với cây bá bệnh.